分光光度计比值所代表的意义-

发布者:admin 发布时间:2019-10-30 00:33 浏览次数:

  分光光度计比值所代表的意义-_物理_自然科学_专业资料。分光光度计 260/280 260/230 比值所代表意义 核酸在波长 260 nm 处有最高吸收峰。 吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的, 所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质,

  分光光度计 260/280 260/230 比值所代表意义 核酸在波长 260 nm 处有最高吸收峰。 吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的, 所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质,不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。但紫外法 不能区分 DNA 和 RNA,只能用来鉴定核酸的纯度和含量。 蛋白质由于含有芳香氨基酸,因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在 280nm 波长处,在 260nm 处的吸收值公为核酸的十分之一或更低,故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。 RNA 的 260nm 与 280nm 吸收的比值在 2.0 以上;DNA 的 260nm 与 280nm 吸收的比值则在 1.9 左右。当样品中 蛋白质含量较高时比值即下降。 如何避免吸光值漂移 读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器, 表现出的吸光值漂移越大。事实上,分光光 度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化,即仪器有一定的准确度和精确度。 1.核酸本身物化性质 溶解核酸的缓冲液的 pH 值、离子浓度等 在测试时,离子浓度太高也会导致读数漂移,因此建议使用 pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液(如 TE) 可大大稳定读数。核酸的吸光值受 pH 值和缓冲液离子浓度影响。只有在一定的 pH 值和低离子浓度的条件 下(如 10 mM Tris-HCl pH 8.0),才能得到精确的检测结果。水的 pH 值不稳定,可能导致检测误差。一 些缓冲液在紫外范围内存在自身吸收,为了确保准确测量,请使用与悬浮或洗脱样品时相同的缓冲液。 2.样品的稀释浓度 同样是不可忽视的因素,由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在 干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响,要求核酸吸光值至少大于 0.1A ,吸光值最好 在 0.1-1.5 A。在此范围内,颗粒的干扰相对较小,结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低,或者过 高(超过光度计的测试范围)。 3.操作因素 如混合要充分,否则吸光值太低, 甚至出现负值;混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移 剧烈; 必须使用相同的比色杯测试空白液和样品, 否则浓度差异太大; 换算系数和样品浓度单位选择一致; 不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。 各波长具体含义及相关问题 1. A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波长,最佳测量值的范围为 0.1 至 1.0。如果不在此范围,稀释或浓缩样品,使 之在此范围内; 如果吸光度小于 0.05, 检查是否存在操作因素 (如移液不准确, 样品内有悬浮物等) 影响。 DNA 样品的 A260 吸光度值是否0.1。(请注意,这个值跟仪器无关,核酸的吸光度必需大于 0.1,其值才 有效和可靠,因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收,其值0.1); 2. A280nm, A270nm 是蛋白最高吸收峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估:纯 DNA 的 A260/A280 比值为 1.8,纯 RNA 为 2.0。如果比值低,表示受到蛋白(芳香族)或酚类物质的污染,需要纯化样品。比值=1.5 相当于 50% 蛋白质/DNA 溶液.酚的最大吸收峰在 270nm。 3. A230nm 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估:纯 DNA 和 RNA 的 A260/A230 比值为 2.5。若比值小于 2.0 标明样品被碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染,需要纯化样品。A230 产生 负值主要是由于在很低 DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中,需要降低样 品的稀释度,A230 的负值会被校正。 4. A320nm 或 A340nm 为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。该值应该接近 0.0。如果不是,标明溶液中有悬浮物,需要纯化 样品。纯样品的 A320 一般是 0。 5. A260/A280 和 A260/A230 是核酸纯度的指示值。纯度好的 DNA 或 RNA,在 pH7-8.5 下 A260 / A280 的比值应该在 2.0 或 2.5。纯净 的样品比值大于 1.8(DNA)或者 2.0(RNA)。如果比值低于 1.8 或者 2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质 的影响。A230 表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物、盐(胍盐)等,较纯净的核酸 A260/A230 的比 值大于 2.0 。 当 0.5%BSA 蛋白质污染时,蛋白污染会导致 260 和 280 的数值都下降,其净结果是 260/280 比值下降, 但 260/280 的比值变化并不显著,正如分子克隆 3 所说。但蛋白残留会导致 230 的数值显著上升,显著影 响 260/230 的比值。也就是说,如果 RNA 样品的 260/280=1.7,260 /230=0.5,那么就应该考虑污染原 因不是胍盐残留,而是蛋白残留. 其他: 用分光光度计测量 RNA 时,用水而不是用 TE 缓冲液稀释 RNA 样品会造成 A260/A280 比值下降。原因是低 离子强度和低 pH 溶液会增加 280 nm 处的光吸收值。 加氯仿离心后取上清的时候千万不要贪多 ,那样就很容易被蛋白污染,所以现在一般取 400ul 左右。 当 260/2301 时,只有两种情况。一是胍盐污染,二是蛋白污染。


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